Полимеразная цепная реакция

ПЦР – это способ, с помощью которого в лаборатории можно быстро получить большое количество копий ДНК. Ну, или РНК. С помощью ПЦР можно также находить преступников, диагностировать заболевания и определять отцовство, но об этом ниже.

Что требуется для ПЦР

1) ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который необходимо размножить (амплифицировать).

2) Два праймера, комплементарные противоположным концам противоположных цепей участка ДНК, который необходимо амплифицировать. (Если вы плохо представляете себе роль праймеров, то вам лучше сначала почитать предыдущую статью, посвященную репликации.)

3) ДНК-полимераза, которая синтезирует ДНК. Для ПЦР используют термостабильную полимеразу архей, живущих при 80°С – она не сваривается при нагревании.

Кроме того, требуются исходные вещества для синтеза ДНК – дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), ионы Mg2+ для работы полимеразы, буферный раствор и прочие биохимические украшения. Кидаем всё это в пробирку, помещаем её в специальный прибор амплификатор и нажимаем кнопку Пуск.


Денатурация 90-96°C
Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 95°C на 1-2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись (при нагревании разрушаются водородные связи между азотистыми основаниями цепей ДНК).

Отжиг 50-70°C
Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

Элонгация 70-72°C
ДНК-полимераза производит синтез второй цепи ДНК от 3'-конца праймера, который связался с матрицей. Элонгацию проводят при температуре наибольшей активности термостабильной полимеразы (72°C) в течение 1-3 минут.

Эти три операции
повторяются друг за другом примерно 50 раз. Количество молекул ДНК после 50 циклов ПЦР могло бы составить 250, это очень много.

Соответственно, праймеров тоже нужно очень много,
а не "два", как написано над рисунком. Смотрите: уже для первого цикла надо 2 праймера, для второго надо еще 4, для третьего еще 8 и т.д. Фактически, прежде чем копировать участок ДНК, надо накопировать множество праймеров (тоже участков ДНК). Как это делается? – Ответ будет дан на следующем факультативе.

Как с помощью ПЦР диагностировать инфекционные заболевания

Представим себе человека, который заразился энцефалитом. Ну, или СПИДом – веселого, в любом случае, мало. (От энцефалита существуют прививки, от СПИДа – презервативы, на этом наш воспитательный классный час окончен, до свидания.)

На ранней стадии очень многие инфекционные болезни похожи на обычный грипп: высокая температура, боль в мышцах и суставах, недомогание; при СПИДе (в самом его начале) ещё и горло болит. Явственных признаков конкретной болезни пока еще нет – только стандартное воспаление. Но ДНК (РНК) вируса уже есть в крови человека, и её можно определить с помощью ПЦР уже на 10 день после заражения – это самый ранний способ определения.

Для теста на СПИД методом ПЦР берут кровь человека, выделяют из клеток множество разных молекул РНК (ВИЧ – РНК-содержащий вирус), проводят их обратную транскрипцию (получают ДНК), а потом пытаются найти среди них ДНК ВИЧа путем ПЦР: добавляют праймеры, комплементарные ДНК ВИЧ и амплифицируют часок-другой. Если после этого в пробирке оказывается очень много ДНК, значит ДНК-матрица для ВИЧ-праймеров в пробе была, человек заражён. Если в пробирке оказываются одни лишь дезоксирибонуклеозидтрифосфаты – пока здоров.

Как с помощью ПЦР находят преступников
(ДНК-дактилоскопия)

В качестве маркёров для ДНК-дактилоскопии обычно используют микросателлиты – участки ДНК, состоящие из множества коротких повторов. Под "коротким повтором" имеется в виду что-нибудь типа AATG. Эти конкретные четыре буковки (микросателлит TPOX) могут повторяться в ДНК человека от 4 до 16 раз: например, у вас они повторяются 10 раз, а у вашего соседа по парте – 7 раз. В стандартном случае проводят анализ на 6-13 повторов (это 8 наиболее часто встречающихся аллелей).


Что нам понадобится для анализа этой последовательности в домашних условиях? Сверяемся с началом статьи:
1) ДНК-матрица – это ДНК любого человека. В ней обязательно будет один из аллелей TPOX (в приведенном примере AATG повторяется 11 раз).
2) Прямой и обратный праймеры (на рисунке обозначены синими стрелками; праймеры могут быть разными у разных производителей).
3) Набор реактивов для ПЦР и недорогой амплификатор должны быть дома у каждого начинающего молбиолога, это понятно.
4) После ПЦР, как мы помним, получается очень много ДНК – настолько много, что её даже можно увидеть невооруженным глазом. Для этого продукты ПЦР подвергаются гель-электрофорезу:

  • кидаются в гель, на одном конце дорожки включается "плюс", на другом "минус"; ДНК – это кислота, заряжена отрицательно, следовательно, будет двигаться к "плюсу";
  • скорость движения ДНК через гель зависит от массы молекулы: чем больше масса, тем медленнее будет движение (легкие куски уедут далеко, тяжелые – недалеко);
  • по окончании электрофореза останется как-либо окрасить ДНК и – вуаля:

Под цифрой 1 у нас "аллельная лестница" – "калибровочная" смесь, которая поставляется производителем вместе с праймерами, это смесь восьми аллелей TPOX, полученных путем ПЦР для данной пары праймеров. Аллели TPOX нумеруются от 6 до 13 (по числу повторов AATG), на картинке слева направо располагаются аллели 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6.

Под цифрой 2 – продукт ПЦР микросателлита TPOX конкретного человека; видно, что у него восьмой аллель.

Теперь он и меня посчитал!

При стандартном геномном исследовании (CODIS) проводят анализ на 13 разных маркеров, результат выглядит примерно так:


Маркёр Аллели

Почему по большинству маркёров два аллеля?
Так и должно быть – один аллель от мамы, один от папы. По нашему родимому Тпоксу и от мамы, и от папы достался 8 аллель, так тоже бывает.

AMEL определяет пол человека, данный генетический профиль принадлежит мужчине.

Точность метода
Каждый маркер, применяемый для геномного исследования, имеет примерно 10 аллелей. Следовательно, вероятность наличия у вас определенного аллеля по одному маркёру равняется 1/10. По двум маркёрам вероятность будет равна 1/10 в квадрате, по трем маркёрам – в кубе и т.д. Вероятность того, что все ваши аллели по всем тринадцати маркёрам КОДИСа совпадут с аллелями другого человека, равняется 1/10 в 12 степени, это одна триллиардная. По моему, достаточно точный метод.

CSF1PO 10, 11
D3S1358 15, 16
D5s818 12, 13
D7s820 9, 10
D8S1179 10, 14
D13s317 9, 12
D16s539 9, 12
D18s51 14, 17
D21s11 29, 30
FGA 23
THO1 7, 8
TPOX 8
vWA 18, 20
AMEL X, Y

Вот, собственно, и все: в базу ФБР занесен ваш генетический отпечаток пальцев. Теперь если в ограбленном банке найдут волос с таким же набором аллелей, вам придется очень долго отмазываться.

Как с помощью ПЦР определяют отцовство

В принципе, это та же самая ДНК-дактилоскопия. Возьмем для примера тот же самый TPOX и посмотрим на результаты того же самого гель-электрофореза:
1) аллельная лестница;
2) 8 аллель предполагаемого отца;
3) 10 аллель ребенка;
4) 9 и 10 аллели матери.

Результаты показывают нам, что ребенок вполне может быть ребенком этой матери (подмены в роддоме не было), но точность такого утверждения не так уж велика – TPOX-10 имеется у 7% жителей РФ. Для однозначного определения нужно исследовать еще парочку маркёров.

С "папой" же ситуация однозначная: он никак не может быть биологическим отцом ребенка. Дальше пошла литература: если, ругая себя за мнительность/ревность, "папа" в тайне от любимой жены и горячо любимого ребенка всё-таки сделал анализ, то это одна история. А если "папа" таким образом успешно отбился от алиментов, то другая.

Тестики

1. Какие из следующих компонентов необходимы для проведения полимеразной цепной реакции
А) обычная ДНК-полимераза из Е. coli 
Б) специальная ДНК-полимераза 
В) праймеры двух видов: к началу и к концу амплифицируемой последовательности 
Г) раствор, содержащий набор дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (А, Т, G, С) 
Д) раствор, содержащий набор рибонуклеозидтрифосфатов (A, U, G, С)

2. Для осуществления ПЦР (полимеразной цепной реакции) необходимы:
А)  праймеры; 
Б) ДНК полимераза, способная выдерживать высокую температуру; 
В) АТФ:
Г) матрица ДНК; 
Д) температура ниже 0ºС.

3. ПЦР (полимеразная цепная реакция) это один из важных молекулярно-биологических методов. Какое/Какие из следующих утверждений о ПЦР НЕ является/являются правильным(и)?
(1) Для ПЦР необходимы праймеры
(2) Необходима ДНК полимераза, способная выдерживать высокую температуру
(3) Для ПЦР необходима АТФ
(4) Для ПЦР необходима матрица ДНК
A) 1, 2
Б) 2, 3
В) 3
Г) 1, 3
Д) 2, 4

4. Миссис Линг-Линг проводит реакции амплификации ДНК и транскрипции в двух отдельных пробирках. Какое из следующих веществ необходимо добавить в обе реакции?
A) АТФ;
Б) Матрицу ДНК;
В) Праймер РНК;
Г) ДНК-полимеразу;
Д) ДНК-лигазу.

5.? Перечислены процессы: 1) плавление, 2) рестрикция, 3) отжиг, 4) элонгация, 5) терминация, 6) инициация. Один цикл ПЦР последовательно включает в себя:
А) 3–1–4–2;
Б) 1–3–4;
В) 1–3–2;
Г) 3–1–2–5.

6. На рисунке показан субстрат для ДНК-полимеразы. Впишите буквенные обозначения (индексы), соответствующие приведенным элементам субстрата.

Элементы субстрата ДНК-полиметазы

Индексы

1) Праймер

 

2) Цепь матрицы

 

3) 3´-конец праймера

 

4) 5´-конец праймера

 

5) 3´-конец матричной цепи

 

6) 5´-конец матричной цепи

 

7. Для амплификации при помощи ПЦР данной последовательности гена
    5’-GCGTTGACGGTATCAAAACGTTAT…
    …TTTACCTGGTGGGCTGTTCTAATC-3’
необходима  следующая пара праймеров:
А) 5’-GCGTTGACGGTATCA-3’ и 5’-TGGGCTGTTCTAATC-3’;
Б) 5’-CGCAACTGCCATAGT-3’ и 5’-TGGGCTGTTCTAATC-3’;
В) 5’-GCGTTGACGGTATCA-3’ и 5’-GATTAGAACAGCCCA-3’;
Г) 5’-TGATACCGTCAACGC-3’ и 5’-GATTAGAACAGCCCA-3’.

8.? 5`-ATGACAGATAAGTACCTGTAGACTAGATCGCTATAGCGGATACACA TCGTCATAGCTGACACATAGCGCTATACAGATTCTCGAT-3`
Вы хотите аплифицировать эту последовательность ДНК при помощи ПЦР. Какие праймеры Вы для этого возьмёте:
1)? 5`-ATGACAGATAAGTACC-3`;
2)? 5`-TATACAGATTCTCGAT-3`;
3) 3`-TATACAGATTCTCGAT-5`;
4)? 5`-ATCGAGAATCTGTATA-3`;
5)? 5`-ATATGTCTAAGAGCTA-3`.

A)? 1, 2;
Б) 1, 3;
В) 1, 4;
Г)? 1, 5.

9. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является методом быстрой амплификации сегментов ДНК. Если к двуцепочечной ДНК добавить необходимые прямой и обратный праймеры (как показано на рисунке ниже), то минимальное число циклов для получения по крайней мере одной копии желаемого фрагмента PQ в виде двухцепочечной ДНК без одноцепочечных концов должно составить:

А) 2;
Б) 3;
В) 4;
Г) 10.

10-12. Др. Чен исследовала функцию гена X у риса с использованием мутанта, в котором Т-ДНК была включена в экзон 2, как это показано на рисунке ниже. Величина Т-ДНК составляла около 5 тысяч пар оснований (kbp). Для генотипирования отдельных растений (A, B, C, D, E) она использовала ПЦР со смесью праймеров I, II, и III и элекеторофорез, как показано на рисунке. На рисунке геля показан результат ПЦР. Молекулярные маркеры размера ДНК показаны на линии М. A-E представляют продукты ПЦР из образцов листьев растений А-E, соответственно. Известно, что использованная полимераза не способна эффективно амплифицировать (увеличивать) фрагменты ДНК размером более 5 kbp.



10. Какая пара праймеров (I+II; I+III; II+III) амплифицирует полосу ДНК на дорожке B?

11. Какое/какие растение(я) (A, B, C, D или E) является/являются гомозиготным(и) мутантом/мутантами?

12. Какое/какие растение(я) (A, B, C, D или E) является/являются потомством F1 гомозиготного мутанта, скрещенного с диким типом?







 
 
 

Ещё можно почитать

Статья "Опыт использования метода ДНК-типирования в экспертизе спорного отцовства", из которой я взял электроэнцефалографию.

Инструкция по применению набора реагентов для определения количества тандемных повторов в полиморфных локусах и пола в геномной ДНК человека.

Представление результатов типирования человека аппаратно-программным комплексом 3130 Genetic Analyser

Очень много информации о микросателлитах (англ.).

Генетические вариации микросателлитов у населения северной и центральной Польши (англ.), у населения Японии, Бангладеш, Индонезии (англ.).

Опрос

На сколько из десяти тестиков вы примерно представляете себе ответ?






Результаты

Расскажите друзьям

0

Комментировать
На главную
 

© Д.В.Поздняков, 2009-2016
E-mail: pozzdd@yandex.ru